前列腺特异性抗原启动子/增强子重组质粒筛选及特异性的体外鉴定

【摘要】目的：利用聚合酶链式反应（PCR）技术从人类基因组DNA中分别扩增PSA启动子（prostate-specificantigenpromoter,PSAP）和增强子（prostate-specificantigenenhancer,PSAE）片段，将扩增的PSA启动子/增强子片段分别克隆入荧光素酶报告基因载体pTAL-Luc，并构建三组含不同调控序列的重组质粒PSAP1-Luc，PSAP2-Luc以及PSAE-Luc，将重组质粒转染入三株不同癌细胞后分别定量检测荧光素酶基因表达情况，以优选具有最强调控基因表达活性的启动子/增强子片段并验证其组织特异性。方法：参照美国NCBINucleotide获得的序列（U37672.1），利用PrimerPremier5.0软件设计PSA启动子和增强子的扩增引物；采用PCR技术分别扩增三个PSA启动子/增强子片段，将扩增出的PSA启动子/增强子片段通过酶切反应分别与荧光素酶报告基因载体pTAL-Luc连接得到三组重组质粒。将三组重组质粒分别和内参照β-半乳糖甘酶共转染入三株癌细胞，前列腺癌细胞（PC-3）、宫颈癌细胞（Hela）和乳腺癌细胞（MCF-7）中，每组重复三次。利用生物化学发光仪及多功能酶标仪分别定量测出荧光素酶活性数值（L值）与β-半乳糖甘酶吸光度值（G值），并计算出两者之间的比值即L/G值，所得的L/G值反映三组重组质粒转染三株不同癌细胞中的荧光素酶基因表达情况，从而筛选出调控外源基因表达最强的PSA启动子/增强子序列并同时进行组织特异性的验证。结果：利用设计好的三对PSA启动子/增强子引物经PCR技术成功扩增出PSAP1片段（537bp），PSAP2片段（620bp）和PSAE片段（1.4kb）；将三个目的基因片段克隆入荧光素酶报告基因载体pTAL-Luc，成功构建出三组重组质粒PSAP1-Luc，PSAP2-Luc和PSAE-Luc；三组重组质粒分别与内参照β-半乳糖甘酶共转染入三株癌细胞结果显示：前列腺癌细胞（PC-3）中所测得的荧光素酶数值与β-半乳糖苷酶的比值（L/G值）最大，比较差异有统计学意义（P＜0.05）；PSAP2-Luc在三组重组质粒中测得的荧光素酶数值与β-半乳糖苷酶的比值最大，比较差异有显著性意义（P＜0.01）。结论：对三组重组质粒转染入三株不同癌细胞的荧光素酶活性评价：前列腺癌细胞（PC-3）中表达的荧光素酶活性高于宫颈癌细胞（Hela）和乳腺癌细胞（MCF-7），表明PSA启动子/增强子调控基因表达具有前列腺组织特异性；PSA启动子和增强子均可调控荧光素酶基因表达，而以包含620bp长度的PSAP2启动子调控的荧光酶基因表达活性最强，其为本实验筛选出的最优长度的PSA启动子序列；筛选出的最优长度PSA启动子将为开展多模态成像监测组织特异性PSA启动子调控表达基因编辑工具–转录激活因子样效应物核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornucleases,TALENs)剪切雄激素受体治疗前列腺癌的可行性研究提供实验依据。
【作者】王丽辉；
【导师】沈钧康；李凯；
【作者基本信息】苏州大学，影像医学与核医学，2014，硕士
【关键词】前列腺特异性抗原；启动子；增强子；质粒；转染；荧光素酶；

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